11 февраля 2014 года
состоялось очередное заседание Президиума Российской академии наук

Члены Президиума заслушали научное сообщение «Гибридные наноконструкции для диагностики и терапии рака»

Докладчик - член-корреспондент РАН Деев Сергей Михайлович.

В докладе представлен цикл работ, посвященных конструированию соединений для высокоточной диагностики и эффективной терапии злокачественных новообразований.

Анонсируется серия работ последних лет, посвященных созданию соединений нового поколения для высокоточного воздействия на опухолевые клетки. В состав созданных бифункциональных соединений входят антитела, осуществляющие адресную доставку, а также действующие агенты. На основе рекомбинантных иммуноглобулинов сконструированы гибридные биосовместимые производные антител с флуоресцентными белками, ферментами, полупроводниковыми флуоресцентными нанокристаллами (квантовыми точками), радионуклидами и др. Эти бифункциональные структуры распознают опухолевые клетки и несут агенты для их визуализации и деградации. С.М. Деевым впервые в мире предложен универсальный принцип, позволяющий целенаправленно собирать различные надмолекулярные комплексы рекомбинантных белков. Для создания мультивалентных мини-антител и их производных Деевым С.М. разработана универсальная платформа на основе белков барназа-барстар – так называемый «молекулярный конструктор». Показана высокая эффективность созданных конструкций для диагностики и терапии рака.

Для повышения эффективности доставки агентов к опухолям предложен совершенно новый принцип создания мультивалентных мини-антител на основе белкового модуля барназа-барстар. На его основе созданы надмолекулярные комплексы рекомбинантных иммуноглобулинов, позволившие осуществить эффективную доставку радиоизотопов к опухолевым клеткам. На модельных животных с опухолями рака молочной железы и рака яичника человека показана высокая эффективность сконструированных надмолекулярных комплексов противораковых рекомбинатных антител. По сравнению с аналогами они обеспечивали существенно лучшую доставку радионуклидов к опухолям и одновременно значительно менее выраженное накопление радиоактивного материала в здоровых органах и тканях.

Впервые с использованием модуля барназа-барстар получены надмолекулярные комплексы рекомбинантных иммуноглобулинов, представляющие собой дивалентные биспецифические мини-антитела, одновременно распознающие два разных онкомаркера (HER1 и HER2/neu), причем компоненты биспецифического димерного антитела независимо наработаны в двух различных системах экспрессии (бактериях и растениях). Такие конструкции способны с повышенной избирательностью связываться с опухолевыми клетками человека, поскольку указанные онкомаркеры часто соседствуют на опухолевых клетках.

Надмолекулярные комплексы на основе модуля барназа-барстар и рекомбинантных иммуноглобулинов, были использованы для разработки универсальной платформы для конструирования иммунореагентов, позволяющей стандартизировать их получение и комбинировать компоненты в зависимости от целей исследования.

Для создания флуоресцентного иммунореагента, предназначенного для визуализации раковых клеток противораковые мини-антитела были присоединены к барназе, а визуализирующие агенты – полупроводниковые CdSe/CdS-нанокристаллы (квантовые точки) – к белку-партнеру барстару. Высокая эффективность и избирательность мечения клеток аденокарциномы яичника человека SKOV3 была достигнута как в случае предварительно сформированного флуоресцентного иммунореагента, так и в случае двухстадийной направленной доставки квантовых точек к раковым клеткам. Таким образом, показано эффективное использование полученных надмолекулярных комплексов полупроводниковых нанокристаллов и рекомбинантных иммуноглобулинов для визуализации HER2/neu-гиперэкспрессирующих опухолевых клеток. Такие флуоресцентные комплексы направленного действия, способные специфически взаимодействовать с маркерами на поверхности опухолевой клетки, открывают принципиально новые возможности для высокоточной молекулярной диагностики опухолевых заболеваний и, как следствие, эффективной терапии, а также могут найти применение для решения различных задач в клеточной биологии и иммуногистохимии.

С целью создания иммунотерапевтических агентов сконструирован новый мультидоменный полифункциональный белок, иммуноРНКаза, состоящий из гуманизированного мини-антитела, специфичного к распространенному раковому маркеру HER2/neu, и рибонуклеазы барназы. Показано, что оснащение токсического агента, барназы, адресующим мини-антителом существенно (на три порядка) увеличивает эффективность ее воздействия на раковые клетки. При этом созданный бифункциональный белок не вызывает выраженных побочных эффектов. Исследование общей токсичности иммуноРНКазы in vivo на модельных животных с ксенографтными опухолями показало, что после однократного введения иммунодибарназы в дозе, в 10 раз превышающей терапевтическую, не наблюдается достоверного уменьшения числа лейкоцитов в периферической крови, выходящего за границы физиологической нормы, а также выраженной системной токсичности. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о высокой перспективности дальнейших доклинических исследований сконструированной иммуноРНКазы как потенциального соединения для создания противоопухолевых иммунобиологических препаратов.

Впервые в мире с целью создания высокоэффективных противораковых иммунофототоксинов на основе рекомбинантных иммуноглобулинов сконструирован полностью генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор. До этой работы соединения для фотодинамической терапии получали только методом химической конъюгации антитела и фотосенсибилизатора, что сопровождалось плохой воспроизводимостью состава, а также не позволяло полностью освободиться от примеси свободного сенсибилизатора, который неселективно накапливался в здоровых тканях, вызывая их сенсибилизацию. В отличие от таких подходов, С.М. Деев и соавт. в качестве фототоксического компонента применили флуоресцентный белок Killer Red, ген которого в единой рамке считывания был присоединен к гену, кодирующему фрагмент противоракового анти-HER2/neu-антитела. Показано, что сконструированный иммунофотосенсибилизатор при облучении специфически поражает клетки аденокарциномы яичника человека SKOV3, гиперэкспрессирующие онкомаркер HER2/neu. Повышение избирательности действия сконструированного соединения определяется сочетанием двух взаимодополняющих факторов: адресной доставкой за счет противоракового антитела и ограничением цитотоксического эффекта зоной облучения. В результате минимизируются побочные эффекты, затрагивающие нормальные ткани.

Это вторая в мире работа по созданию полностью генетически кодируемых иммунофототоксинов. Продолжая свои исследования [6,7] С.М. Деев и соавт. сконструировали новый иммунофотосенсибилизатор на основе фототоксичного флавопротеина miniSOG, обладающий высокой селективностью к HER2/neu-антигену и вызывающие гибель HER2/neu-положительных клеток лишь при непосредственном облучении (IC50=160 нМ).. Было установлено, что созданный иммунофототоксин проявляет цитотоксический эффект, в 10 раз, превосходящий таковой для химического конъюгата порфирина с таким же адресным доменом (мини-антителом anti-HER2/neu-scFv).

Применение созданного иммунофототоксина в комбинации с традиционными цитостатиками (Taxol) или с веществами белковой природы, нарушающими межклеточные контакты в раковых опухолях эндотелиального происхождения, значительно усиливало его действие, понижая IC50 до 20 нМ.

Эти работы [5-8] наглядно демонстрируют, что разработка адресных генетически кодируемых иммунофототоксинов, обладающих способностью избирательно поражать опухоль, становится одной из актуальнейших проблем современной фотодинамической терапии, и они могут стать альтернативой существующим химическим конъюгатам фотосенсибилизаторов с антителами..

В этих публикациях излагаются принципы предложенной универсальной технологии получения надмолекулярных комплексов на основе рекомбинантных иммуноглобулинов и белкового модуля барназа-барстар. Обобщены работы авторского коллектива под руководством С.М. Деева по молекулярному конструированию, позволяющему получать моно- и мультивалентные мини-антитела, их производные с заранее заданными свойствами и возможности улучшения характеристик мини-антител, используемых для нацеливания на опухоли. Показано, что перевод рекомбинантных антител в мультивалентный формат увеличивает их функциональную активность, уменьшает диссоциацию с клеточной поверхности и оптимизирует биораспределение, что является необходимым условием для точной диагностики и эффективной терапии злокачественных новообразований.

Первая работа из выдвигаемой серии была опубликована С.М.Деевым в 2003 г. в журнале «Nature Biotechnology». В 2004 г. ее анонсировали в «Faculty of 1000» – издании, которое отбирает лучшие публикации по биологии. Там предложенный принцип «молекулярного конструктора» сравнили с известным конструктором «LEGO».

Полученные результаты получили международное признание и относятся к достижениям мирового уровня. Они важны как для развития фундаментальной науки, поскольку предлагают оригинальную стратегию конструирования олигомерных надмолекулярных комплексов для диагностики и терапии рака, так и для задач практической биомедицины, поскольку уже созданные соединения могут быть востребованы для лечения большой группы злокачественных новообразований, что определяет высокую социально-экономическую значимость разработок.

1. Deyev, S.M., R. Waibel R., E.N. Lebedenko, A.P. Schubiger, A. Plückthun. 2003. Design of multivalent complexes using the barnasebarstar module. Nature Biotechnology 21, 1486-1492.
2. Semenyuk, E.G., O.A. Stremovskiy, E. Edelweiss, O.V. Shirshikova, T.G. Balandin, Y.I. Buryanov, S.M. Deyev. 2007. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants. Biochimie. V. 89. №1: P.31-38.
3. Zdobnova T.A,. S. G. Dorofeev, P.N. Tananaev, R.B. Vasiliev, T.G. Balandin, E.F. Edelweiss, O.A. Stremovskiy, I.V. Balalaeva, I.V. Turchin, E.N. Lebedenko, V.P. Zlomanov, S.M. Deyev. 2009. Fluorescent immunolabeling of cancer cells by quantum dots and antibody scFv fragment. J. Biomed. Opt. V. 14, 021004.
4. Edelweiss, E, T.G. Balandin, J.L. Ivanova, G.V. Lutsenko, O.G. Leonova, V.I. Popenko, A. M. Sapozhnikov, S.M. Deyev. 2008. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells. PLoS ONE. 3, e2434.
5. Balandin, T.G., E. Edelweiss, N. V. Andronova, E. M. Treshalina, A. M. Sapozhnikov, S.M. Deyev. 2009. Antitumor activity and toxicity of anti-HER2 immunoRNase scFv 4D5-dibarnase in mice bearing human breast cancer xenografts. Invest New Drugs. 2011. V. 29. P. 22-32...
6. Serebrovskaya, E.A., E. Edelweiss, O. Stremovskiy, K. Lukyanov, D. Chudakov, S.M. Deyev. 2009 Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosesitizer fusion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 9221-9225.
7. Серебровская Е. О., Стремовский О. А., Чудаков Д. М., Лукьянов К. А., Деев С. М. Генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор. Биоорган. химия. 2011. Т. 37. № 1. С. 137–144.
8. Mironova K.E., Proshkina G.M., Ryabova A.V., Stremovskiy O.A., Lukyanov S.A., Petrov R.V., Deyev S.M. Genetically encoded immunophotosensitizer 4D5scFV-miniSOG is a highly selective agent for targeted photokilling of tumor cells in vitro.
Theranostics. 2013. 3(11):831-840. doi:10.7150/thno.6715.
9. Deyev, S.M., E.N. Lebedenko. 2008. Multivalency - the hallmark of antibodies used for optimization of tumor targeting by design. BioEssays. V. 30. P. 904-918.
10. Деев С.М., Лебеденко Е.Н. 2009. Инженерия антител: молекулярный конструктор на основе модуля барназа-барстар. Биоорган. химия. Т. 35. С. 761-778.
11. Деев С.М., Лебеденко Е.Н. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения. Acta Naturae. 2009. № 1. С. 32-50.
12. Поляновский О.Л., Лебеденко Е.Н., Деев С.М. ERBB-онкогены – мишени моноклональных антител. Биохимия. 2012. Т. 77. Вып. 3. С. 289-311.

В обсуждении научного сообщения приняли участие:

Академик Георгиев Георгий Павлович, академик Кирпичников Михаил Петрович, член-корреспондент РАН Габибов Александр Габибович, академик Петров Ром Викторович, академик Островский Михаил Аркадьевич, член-корреспондент РАН Сергеев Александр Михайлович, академик Григорьев Анатолий Иванович, академик Дедов Иван Иванович, академик Фортов Владимир Евгеньевич.

Члены Президиума обсудили и приняли решения по ряду других научно-организационных вопросов.

Видеозапись заседания