Исследование Института биоорганической химии им. ак. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН и МГУ им. М. В. Ломоносова поможет разработать нормы безопасного применения наноматериалов, которые все шире используются в предметах повседневного быта.

В повседневной жизни наночастицы алмаза можно встретить в материалах для шлифования, полировки, в качестве армирующих добавок в сверлах, пилах, бурах и других инструментах. Графитовый порошок добавляют в резины, бетоны и асфальты для улучшения механических свойств. Таким образом, даже обычные люди сталкиваются с этими частицами повсеместно.

При этом результаты, полученные в последнее время в различных лабораториях, не дают точного ответа на вопрос о биологической безопасности наночастиц на основе углерода. Ранее авторы данного исследования обнаружили, что воздействие углеродных нанотрубок на бактериальные клетки приводит к их разрушению. Между тем алмаз и графит – это тоже материалы на основе углерода. Ученые задались вопросом, а как подействуют наночастицы алмаза и графита на такие же бактерии?

В качестве наночастиц алмаза в исследовании были использованы порошки ультрадисперсного алмаза размером 4‒5 нм, полученные детонационным методом. Наночастицы графита были получены из кристаллов пиролитического графита с помощью обработки ультразвуком.

Рис. 1. Полученные с помощью растровой электронной микроскопии изображения образцов наночастиц алмаза (а) и графита (б).

Для проведения экспериментов были использованы суспензии этих двух видов наночастиц в дистиллированной воде в концентрациях 160,0 мкг/мл. Исследовалось их воздействие на ту же биологическую тест-систему, что использовалась в экспериментах с нанотрубками.

Это тест-система на основе бактериальной люминесценции. В ней применяется штамм бактерии Escherichia coli K12 TGI с созданным генно-инженерным методом светящимся фенотипом (фенотип – внешнее проявления генотипа). Штамм получен и хранится на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова и известен как биосенсор тест-системы «Эколюм-06».

Для определения токсичности наночастиц или любых других веществ их добавляют в суспензию, содержащую светящиеся бактерии. Люминесценцию этой суспензии сравнивают с люминесценцией контрольного образца, в котором наночастиц нет. По измеренной люминометром разнице интенсивности свечений определяют, насколько изменилось количество живых бактерий в суспензии под действием тестируемого вещества.

В результате определяется индекс токсичности Т, который представляет собой процент уменьшения свечения образца по сравнению с контролем. Т=100 означает, что все бактерии умерли, если Т=0, то все бактерии выжили. Принято, что Т меньше 20 обозначает, что образец нетоксичен; значение Т больше 20, но меньше 50 – образец токсичен; значение Т больше 50 – образец очень токсичен.

Эксперимент показал, что после 48 ч. воздействия графитовых наночастиц их индекс токсичности Т оказался равен 18 ± 2, а для алмазных наночастиц Т= ‒ 9 ± 1, то есть свечение образца не только не уменьшилось по сравнению с контрольным, но даже возросло. Наблюдалась стимуляция свечения тест-организма, то есть алмазные наночастицы оказались биоактивными.

Безопасность данных веществ для бактерий была подтверждена еще двумя способами.

Рис. 2. Изображения образцов бактериального биосенсора через 3 ч. (а, в, д) и через 2 суток (б, г, е) после начала эксперимента; а, б – контрольные образцы; в, г – образцы с наночаcтицами алмаза; д, е – образцы с наночастицами графита.

Методом растровой электронной микроскопии изучались изменения в морфологии клеток бактерий, имевших прямой контакт с алмазными и графитными наночастицами. Как видно из изображений, представленных на рис. 2, на протяжении 2 суток морфологических изменений бактерий не происходило. Это позволило заключить, что, в отличие от случая взаимодействия с углеродными нанотрубками, клеточные стенки и мембраны бактерий остаются целостными, и клетки более устойчивы к механическому воздействию этих частиц.

Отсутствие негативных изменений в структурах бактериальных клеток также было подтверждено исследованиями выживаемости клеток.

Рис. 3. Рост оптической плотности (отражает рост числа бактерий) в суспензиях клеток биосенсора, выращенных с наночастицами алмаза и графита, относительно контроля без наночастиц.

На рис. 3 представлен полученный в эксперименте по инкубации бактерий с графитом и с алмазом в течение 24 ч. график зависимости оптической плотности суспензии от времени. Оптическая плотность позволяет оценить суммарное накопление бактериальной биомассы, включая живые и мертвые, активные и неактивные клетки. Рост оптической плотности – показатель роста числа бактерий. На рис. 3 видно, что рост клеток в присутствии наночастиц алмаза оставался на том же уровне, что и в контроле. Это значит, что наночастицы алмаза в исследованных концентрациях не оказывали влияния на клеточное деление. А вот частицы графита значительно стимулировали рост оптической плотности, и через 20 ч. наблюдался прирост биомассы в 2,5 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, исследования показали, что алмазные и графитные наночастицы, в отличие от углеродных нанотрубок, в водных суспензиях в изученном диапазоне концентрации оказались безопасными и нетоксичными для бактерий. Как показано многочисленными исследованиями, методы биотестирования на основе светящихся микроорганизмов коррелируют с ответной реакцией высших организмов на аналогичное воздействие.

Подробнее см. «Действие наночастиц углеродной природы с различной структурной организацией на биологические системы штамма Escherichia coli K12 TGI», Е. В. Сорокина, Е. А. Образцова, «Микробиология», 2022, т. 91, № 3, стр. 334–340.

Редакция сайта РАН