Исследователи из Лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН) усовершенствовали метод получения образцов геномной ДНК из грибов для ПЦР-диагностики.

Представители царства Fungi крайне многочисленны, в цитируемой литературе насчитывают около 1,5 миллиона видов, но по прогнозу фактическое разнообразие грибов оценивается в пределах от 2,2 до 3,8 миллионов видов. Грибы вездесущи, обитая во всех ареалах, они играют важную роль в деструкции (катаболизме) всевозможных органических молекул. По этой причине грибы по праву занимают положение одних их наиболее активно изучаемых живых организмов. Особый интерес представляют виды грибов, используемые в пищевой, хозяйственной или медицинских целях, а также патогенные виды, опасные для здоровья человека и животных. В связи с большой практической значимостью дрожжи и грибы интенсивно изучаются как традиционными микологическими и генетическими методами, так и современными молекулярно- биологическими методами. В последние годы в диагностике и таксономии грибов широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР). При постановке ПЦР необходимо иметь в наличии в достаточном количестве ДНК с минимальным содержанием белков и других примесей, способных ингибировать ДНК-полимеразу. Как известно, грибы и дрожжи обладают очень прочной клеточной стенкой, поэтому они выдерживают обработку растворами детергентов, щелочей и солей-хаотропов, что затрудняет выделение ДНК из этих объектов для анализов. Разработанные и продаваемые растворы/наборы для выделения образцов ДНК из разных типов клеток, имеют ограниченное применение в случае грибов.

В новой работе, опубликованной в журнале Analytica Chimica Acta, авторы описывают новую процедуру эффективного получения полу-проницаемых оболочек грибковых клеток, внутри которых сохраняется геномная ssДНК, подходящая для использования в ПЦР в качестве матрицы. Эта процедура основана на нагревании клеток в смеси хаотропных агентов, детергентов, хелаторов и слабой щелочи, что приводит к практически полной экстракции РНК и большей части белков из клеток наружу. При этом ~99% всей ДНК остается внутри клеточных оболочек. Использование смеси, содержащей 7 М мочевину, 1% додецилсульфата натрия (SDS), 100 mM аммиака и 25 mM цитрата натрия, было наилучшим вариантом для получения высокоочищенных ДНК-содержащих клеточных оболочек из 8 штаммов грибов, включая клинические изоляты Candida и Cryptococcus. При обработке хаотропными смесями клеточные стенки грибов подвергаются разрыхлению и истончению, что подтверждалось данными электронной микроскопии. Разработанный исследователями простой, быстрый и недорогой подход к получению валидных матриц для ПЦР может найти применение в молекулярной диагностике и таксономии.

Источник: ИБХ РАН