Институт аналитического приборостроения РАН совместно с компанией «Синтол» завершил разработку отечественного секвенатора для массового параллельного секвенирования ДНК. Прибор называется «Нанофор СПС», работает по принципу секвенирования путем синтеза на отечественной реагентике, совместимой с реагентами Illumina. О том, как шла его разработка, мы беседуем с Яковом Алексеевым, директором по науке и сооснователем компании «Синтол».

Как возникла идея сделать российский прибор для секвенирования путем синтеза?

Это логическое продолжение разработок, которые велись с начала 2000-х нашим консорциумом. Когда мы начали работать с Институтом аналитического приборостроения РАН в Санкт-Петербурге, у них был задел по приборам капиллярного электрофореза. В 2014–2015 годах мы вывели в серию прибор «Нанофор 05». В настоящее время выпущено более 200 приборов. Логическим продолжением нашей совместной работы стала разработка отечественной технологии массового параллельного секвенирования ДНК, NGS. Производительности классических секвенаторов не хватало для решения задач расшифровки полных геномов, а такие задачи множились. Как ни странно, тогда на рынке доминировали приборы для полногеномного полупроводникового секвенирования ДНК от компании Thermo Fisher.

Но теперь-то Illumina захватила рынок …

Подождите, сейчас с ними все более активно конкурируют китайские компании… Собственно, основная причина успеха Illumina – точность секвенирования. По производительности многие приборы были сопоставимы, но по точности Illumina давала фору. Мы приобрели их секвенатор MiSeq, позволяющий расшифровывать небольшие геномы. На этом приборе мы начали осваивать технологию массового параллельного секвенирования, разобрались с программой, с протоколом, и шаг за шагом, стали тестировать свою химию на этом приборе. А параллельно в Питере начали готовиться к запуску проекта.

Расскажите подробности. Начало – это всегда интересно, тем более что разработка требует вложений…

Можно сказать, этот проект был получен почти случайно, благодаря стечению обстоятельств: меня как эксперта привлекли для экспертизы двух научно-исследовательских работ в Минздраве. На глаза попался план Федеральной целевой программы «Химическая и биологическая безопасность Российской Федерации», в котором последним номером было написано мероприятие: «разработка полногеномного секвенатора». Разработку прибора планировалось завершить к концу программы – в 2020-м году. А я эту бумагу увидел в середине 2018 года. «Остается же очень мало времени! Такой прибор, безусловно, нужен позарез. Если у вас есть деньги, давайте мы будем его делать!» – предложил я коллегам из Минздрава России. Летом 2018 года был проведен конкурс, и наша команда победила. Несмотря на то, что разработка на тот момент казалась технически сложной, в 2019 году мы уже макетировали основные элементы. У нас были идеи, как сделать самое сложное – оптическую систему.

Кто интегрирует разработку? Как это происходит? Можете больше про команду рассказать?

Мы идем от задачи. К нам обращались клиенты из разных организаций медицинского, сельскохозяйственного профиля, из судмедэкспертизы и так далее. И они говорили: «Нам нужны большие геномы». Или хотя бы малые, но полные. Опыт у нас уже больше 25 лет, мы разные задачи решали, а теперь – такую объёмную, как создание «Нанофора СПС».

«Мы» – это кто?

Наш консорциум. Первый участник – Институт аналитического приборостроения РАН в Санкт-Петербурге: то малое количество людей, которое сохранилось из некогда крупного предприятия с численностью сотрудников около 4 тысяч человек – в советские времена оно называлось «Научно-техническое объединение АН СССР» и, кроме института и специального конструкторского бюро, включало еще несколько заводов по стране. И вторым участником консорциума как раз и оказался один из чудом выживших заводов в Черноголовке – Экспериментальный завод научного приборостроения (ЭЗАН). Ключевым являлось то, что не были потеряны связи. Был опыт передачи конструкторской документации из института на завод и затем серийного освоения – они делали масс-спектрометры с ионизацией спреем. Так называемый электроспрей, разработка советских ученых. А третьим участником консорциума явилась наша компания «Синтол», которая взяла на себя ответственность за разработку химии, биологии, ведение этого проекта с точки зрения методистов. То есть мы говорили технарям, что нужно, исходя из понимания биологических процессов, заложенных в этот метод. Все базовые элементы метода массового параллельного секвенирования были разработаны советскими и российскими учёными. Поэтому, когда мне задают вопрос, боимся ли мы патентных споров, я говорю, что не боимся, потому что у нас есть четкие доказательства того, что базовые элементы технологии были опубликованы за 10 и более лет до возникновения компании Illumina.

Давайте про патенты подробнее. Патенты на такие штуки ведь всегда очень сложные. Там патентуется все. Химия – отдельно, ячейка – отдельно, потом сам прибор, общая схема… Тома этих патентов. На одной из конференций вы говорили, что большинство патентов у Illumina все равно истекает в ближайшее время, так?

Да. Но во всех своих презентациях я говорил о заслугах и первенстве советских и российских ученых, поскольку во всей технологии Illumina есть три ключевых элемента, без которых она бы не работала. Первый элемент – молекулярные колонии, разработка Александра Борисовича Четверина из Института белка РАН. Я с ним знаком много лет, мы обсуждали много интересных фактов из его жизни. Так, он летал в США и выступал в суде на стороне компании Thermo Fisher, которая в свое время приобрела у Института белка РАН патент на молекулярные колонии. И судился Thermo Fisher как раз с Illumina. Тогда они доказали, что приоритет имеет Институт белка РАН, и Illumina была вынуждена купить лицензию у своего конкурента – компании Thermo Fisher. Второй элемент технологии – пришивка на поверхность ячейки адаптеров с использованием технологии гидрогелевых биочипов, разработанной группой Андрея Дарьевича Мирзабекова. Еще в начале 90-х они сделали целый ряд публикаций, где была раскрыта химия этой пришивки. И третье – это обратимо терминированные трифосфаты, это работа Сергея Григорьевича Завгороднего с коллегами, одна часть группы была в Институте биоорганической химии РАН, другая – в Институте молекулярной биологии РАН. Они написали короткую статью в зарубежном журнале в 1991 году, посвященную ультрамягким защитным группам, и в самой последней строчке сказали, что именно эти азидометильные защитные группы представляются для них основным кандидатом при работе с ДНК. Поскольку, если снять эту защиту, то структура ДНК не искажается. Ты встроил нуклеотид, потом снял, и так много раз.

То, в чем секвенирование Illumina и заключается… Давайте еще немного о приоритетах. Четверин, насколько помню, разработал метод молекулярных колоний для РНК еще в начале-середине 90-х. Но совсем не для секвенирования.

Это верно, но, когда он написал патент, в перечислении методов, для чего этот подход может применяться, он четко написал о секвенировании нуклеиновых кислот. Это ключевой момент.

А Мирзабеков? Ведь он работал над секвенированием на чипах, и, насколько помню, у них так и не получилось довести разработку до конца.

Да, сама технология секвенирования нуклеотидными библиотеками на поверхности гибридизационных ячеек не пошла, но они умели пришивать на поверхность стекла синтетические олигонуклеотиды, что является составной частью NGS.

А это сложно?

Когда ты уже сделал, это не сложно. Но вот мы сначала полтора года читали разные американские патенты, пытались их воспроизвести. И когда уже стало поджимать время, пришла мысль: зачем мы так мучаемся, идем такими сложными ходами? И просто сделали то, что я еще студентом МГУ делал каждый день, – полимеризацию на поверхности стекла, но без добавления кросс-сшивающего агента. Это самая простая методика, когда добавляется инициатор, катализатор, акриламид и ваш олигонуклеотид, который содержит двойную связь. Вот и все. И все это выстраивает структуру на поверхности ячейки, с которой потом уже происходит генерация кластеров в тех местах, где прикрепилась ДНК.

Вы сказали, что самое сложное – это оптика. Ее кто делает?

Разработку оптики вел Институт аналитического приборостроения РАН, в Питере. У них есть группа очень опытных специалистов, которой руководит Владимир Ефимович Курочкин. Они сделали уникальную оптику для «Нанофор 05», которая не похожа на американскую или китайскую. И из-за этого прибор имеет целый ряд преимуществ, в частности, мобильность. Собственно, оптическая система «Нанофор 05» была частично заимствована в новом приборе.

За реагентику и химию отвечает «Синтол»? Большая у вас команда?

Десять-пятнадцать химиков, биологов, энзимологов… Прямо скажем, небольшой коллектив по сравнению с Illumina. Вся химия внутри картриджа – 12 основных компонентов реакционных смесей – российская. Пусть мы не можем сделать микроэлектронную плату или КМОП-матрицу серийно, но сделать хороший, точно и эффективно работающий фермент мы можем.

Где находится производство?

Мы по сей день делали в небольших масштабах, у нас же пока нет парка приборов, есть лишь две сотни запусков, нам пока достаточно своей химии. Но, с другой стороны, у нас в стране есть производство ферментов, исчисляемое сотнями литров, на профессиональных площадках, например, в Институте биоорганической химии РАН.

А электронная начинка и программное обеспечение?

Электроника пока импортная. Программное обеспечение наше. Это математики, программисты – большой отдел в Институте аналитического приборостроения РАН. Они написали и программу управления, и распознавания очень сложных комбинаций кластеров, позволяющую получать данные высокого качества.

У Illumina закрытый программный код? А нельзя было в таком случае просто взять их алгоритм и не делать самим?

Открытый. Это нам помогло на первых этапах. Изначально мы и пользовались этим алгоритмом, но параллельно делали свой, понимая, что есть компетенции, есть специалисты, которые могут сделать лучше, и это конкурентное преимущество.

Что нового по сравнению с Illumina будет в этом приборе?

Мы очень рассчитываем, что в ближайшее время нам удастся увеличить длину чтения. Правда, на это же рассчитывает и Illumina. Сейчас можно хорошо прочитать 300 нуклеотидов. Потом качество резко падает, и уже нет смысла продолжать процесс секвенирования. И связано это с эффектом шрамирования ДНК – когда отщепляется флуоресцентная метка, одновременно освобождается группа 3’-гидроксила, у вас остается маленький синтетический фрагмент, который копится. И ферменту это очень не нравится. Фермент ошибается, и количество ошибок к трехсотому шагу сиквенса драматически снижает качество. Благодаря новым разработкам мы рассчитываем, что сможем прочитать хотя бы 400.

Когда же «Нанофор СПС» появится на рынке, на какой рынок вы рассчитываете и по какой цене?

21 апреля этого года мы заключили лицензионное соглашение с Министерством здравоохранения. Поскольку серия установочная, сам прибор дороже, чем MiSeq, он стоит 14,7–15 млн рублей, а MiSeq – 12–13 млн. Тут есть объективные сложности: матрицы импортные, лазеры недешевые, хотя и отечественные. Но дальше будет важна стоимость владения. У «Нанофора СПС» стоимость запуска будет дешевле, потому что мы производим все компоненты. Это наша химия, наши ферменты, и мы можем масштабировать так, как захотим и, соответственно, регулировать себестоимость. В этом наше преимущество. В России рынок генетических исследований маленький, MiSeq стабильно продавали по 25–30 приборов в год, столько же своих полупроводниковых приборов продавал Thermo Fisher. Но если прибор в серии у нас получится хороший, надежный, то, конечно, его рыночный потенциал выше: если стране таких приборов нужно в год 100, то в мире – 1000. Мы планируем с новым прибором выйти на экспорт, как уже сейчас делаем с «Нанофор 05».

Какие дальше планы?

Во-первых, зарегистрировать «Нанофор СПС» и всю реагентику как медицинские изделия. Во-вторых, предстоит решить задачу передачи на завод конструкторской документации для организации серийного производства. Далее необходимо срочно начать разработку более производительного прибора по той же технологии массового параллельного секвенирования, прежде всего для решения задач персонализированной медицины. Параллельно мы занимаемся подготовкой молодых специалистов. У нас хорошая команда!

Антон Максимов.
Источник: PCR.news.