Специалисты Международного томографического центра СО РАН предложили новую классификацию сибирских видов птиц, основанную на данных о продуктах обмена веществ в их хрусталиках. Подобные исследования помогут биологам и орнитологам более точно систематизировать животных.

Большинство филогенетических или эволюционных деревьев, как правило, строятся по данным о последовательностях нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) животных. Однако эти построения не дают абсолютно точной и надежной информации об историческом развитии видов, из-за чего иногда возникают трудности в составлении наиболее достоверной классификации. Ученые МТЦ СО РАН предположили, что комбинация геномики (науки о совокупности генов) и метаболомики (науки о метаболоме) потенциально может решить возникающие споры.

Метаболом – это совокупность малых молекул в организме: углеводов, витаминов, аминокислот и многих других классов химических соединений, которые называют метаболитами. Они поддерживают нормальное функционирование клеток, органов и тканей, а также активно участвуют в обмене веществ. Исследователи поставили цель проанализировать данные о метаболоме птиц с помощью статистических методик, тем самым по возможности проследить исторические взаимосвязи между видами, и установить влияние на него образа жизни.

Для проведения такого типа анализа ученые использовали хрусталики глаза 14 видов птиц из 6 отрядов, идентифицировали в них наиболее распространенные метаболиты и установили их концентрации.

«Хрусталик – это прозрачное, анатомически изолированное от других тканей тело. Основная доля составляющих его клеток обладает нитевидной формой, которые в отличие от „живых” клеток лишены ядер и органелл, за счет чего и обеспечивается прозрачность хрусталика. Последние формируют тонкий монослой на его поверхности, где нарабатываются метаболиты, практически полностью обеспечивающие жизнедеятельность нитевидных клеток и поддержание гомеостаза – нормального функционирования хрусталика. Раз хрусталик так сильно на них полагается, мы решили подробнее изучить его в нашем эксперименте», – рассказывает старший научный сотрудник лаборатории протеомики и метаболомики МТЦ СО РАН кандидат физико-математических наук Вадим Владимирович Яньшоле.

Перед основной работой ученые провели базовые приготовления, связанные с выделением метаболомной фракции (слоя).

«Как сложную смесь веществ клетку или ткань можно условно разделить на следующие составляющие: белки, ДНК и РНК, липиды, метаболиты. Когда речь идет о выделении фракции из сложной смеси, имеется в виду отделение от нее чего-то одного, в нашем случае метаболитов. Вначале мы разрушили клетки в тканях и убрали ненужные нам макромолекулы: белки и липиды, которые могли испортить качество спектров. Для этого мы помещали образец, состоящий из одного или двух-трех хрусталиков, в зависимости от их размеров, в стеклянную пробирку, содержащую холодный раствор метанола, воды и хлороформа, и гомогенизировали (делали однородным по составу) при помощи современного гомогенизатора TissueRuptor II. Далее мы ставили пробирку в лабораторный шейкер, где жидкость равномерно перемешивалась до полного прекращения действия всех ферментов, отвечающих за превращение одних метаболитов в другие. Полученную смесь мы выдерживали при температуре -20 ℃ и затем центрифугировали, то есть помещали смесь в центрифугу, где под действием центробежной силы она разделялась на три фракции: верхний, жидкий водно-метанольный, средний, твердый белково-липидный, и нижний, жидкий метанольно-хлороформенный, слои», – объясняет В. В. Яньшоле.

Верхний слой, содержащий метаболиты, разделялся в соотношении 2/3 для анализа на спектрометре ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и 1/3 для жидкостного хроматографа UltiMate 3000RS в сочетании с масс-спектрометром высокого разрешения maXis 4G (ЖХ-МС), который использовался для идентификации метаболитов. Основную работу по определению их концентрации ученые проводили при помощи ЯМР-спектрометра AVANCE III HD в Центре коллективного пользования «Масс-спектрометрические исследования» СО РАН. Ампула с веществом помещалась внутрь устройства в область сильного магнитного поля и облучалась высокочастотным электромагнитным полем. Метаболиты поглощали частоты, после чего регистрировался ЯМР-спектр – линия, состоящая из пиков различной высоты. Положения вершин и площади пиков показывали наличие и количество определенных метаболитов в составе образцов прямо пропорционально их концентрации: если сигнал был слабый, значит, искомых соединений там было мало, если сильный – то наоборот, много.

Всего в данной работе исследователи обнаружили 67 наиболее распространенных и 7 пока еще неизвестных соединений в составе хрусталиков птиц, среди которых основными оказались таурин и мио-инозитол – их концентрация составила выше 20 микромоль на грамм ткани.

Информацию, полученную в ходе анализа, ученые заносили в созданную МТЦ СО РАН базу метаболомных данных Animal metabolite database (AMDB). В этой системе содержатся материалы о метаболитах животных, описание и количество используемых образцов тканей (мышц, крови, хрусталиков и так далее) и многое другое. Помимо этого, в ней можно осуществлять поиск необходимой информации и проводить первичную статистическую обработку данных.

При помощи веб-платформы MetaboAnalyst 5.0 ученые составили дендрограмму (древовидную диаграмму) и сравнили ее с двумя современными филогенетическими деревьями: 2014-го (Jarvis et al.) и 2021 (Kuhl et al.) года, включающими 48 и 429 видов птиц соответственно, в том числе 14 исследуемых в МТЦ СО РАН. В проектах представлены не только эволюционные взаимосвязи различных видов, но и анализ полного генома у представителей всех отрядов птиц. Вышеназванные работы несколько отличаются друг от друга по классификациям, но тем не менее широко цитируются другими учеными и считаются классическими для большинства современных исследований.

Сравнив все три построения между собой, специалисты МТЦ СО РАН пришли к выводу, что их дерево очень похоже на классические эволюционные деревья, однако существует различие, которое, как думают исследователи, связано с образом жизни и питанием птиц. 

«Нам было интересно сравнить расположения птиц на деревьях, основанных на метаболомике и геномике. Как оказалось, наша дендрограмма во многом напоминает деревья из литературных источников, однако между ними есть различия в расположении видов, которые могут быть обусловлены образом жизни птиц. Возьмем, к примеру, лысуху и ворону. Питание обеих, вероятно, очень схоже, что влияет на состав и концентрацию метаболитов. Деревья на основе геномики не учитывают тип потребляемой пищи, поэтому на нашей схеме данные виды расположены ближе друг к другу», – комментирует В. В. Яньшоле.

В дальнейшем ученые планируют продолжить работу: расширить видовое разнообразие, посмотреть другие классы животных, а также развить используемые статистические подходы для построения деревьев и объяснить наблюдаемые различия в метаболомных данных по сравнению с геномными.

Научное исследование, а также создание и развитие базы данных AMDB о метаболитах животных получили финансовую поддержку со стороны Российского научного фонда (грант № 21-74-00068, № 22-24-00390) и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 18-29-13023).

Источник: «Наука в Сибири».
Автор текста: Полина Кустова.